Ми розробили стратегію ізоляції на основі Асо РНК, назвав поїздку, щоб захопити зокрема мРНК з їх пов'язаних білків з трьох різних організмов37. По суті, зшитими в природних умовах були комплекси РНК білок, УФ випромінювання клітин на 254 Нм і poly (A) РНК були відновлені з комерційно доступних oligo (dT) поєднанні магнітні намиста, то mRNA інтересу був ізольований з 3'-біотінілірованние 2-0 '-метоксі зміна антисмислових олігонуклеотидів РНК (рис. 1). Тому ми покликані регіони в обраній mRNAs кілька ASOs НТС змінена 21-24 з повною взаємодоповнюваності від дріжджів, C. elegans і людини і перевірку їх придатності для відновлення mRNA інтересу (список грунти і ASOs дається в таблиці 1). ефективність і специфіку окремих ASOs вперше були оцінені з не шитий всього РНК, ізольований від відповідних організму. У цих експериментах РНК ASOs були поєднанні кон'югованих стрептавідину парамагнітних бісером і інкубували із загальною РНК не зшитий з відповідного організму. Після звільнення захоплених мРНК з бісеру, присутність mRNA мети також відносини управління mRNAs контролюється зворотної транскрипції (RT) -полімеразной ланцюгової реакції (ПЛР) 37. Ми помітили, що дві змінні, концентрація солі і температури прання буферів, зіграв вирішальну роль в ефективності уловлювання мРНК PFK2 з дріжджів, який був протестований з трьома різними ASOs (малюнок 2A). Зниження концентрації солі (NaCl) до 25 мм скорочені відновлення негативних контролювати мРНК (PFK1) не піддаються виявленню рівнів з усіма ASOs, але вона також скоротила відновлення потрібної цільової мРНК PFK2 (10-15% від введення). І навпаки, збільшення концентрацій солі до фізіологічних рівнів (150 мм NaCl) збільшення відновлення мРНК PFK2 до 75% з Асо PFK2-2, що перевищує елемента управління PFK1 мРНК, по крайней мере 5 разів (рис. 2A). Далі слід відзначити різні ASOs показав великі варіації мРНК вузькоспеціалізованого захоплення цілі на фізіологічної солі концентрації, наголошуючи на необхідності емпіричні перевірки ASOs. Залежність температури прання буфера мРНК відновлення є прикладом C. elegans ВІС-1 і дріжджі RPS20 мРНК, використовуючи відповідні ASOs (Таблиця 1). Ми спостерігали, що оптимальної температури від 50 ° C до 55 ° C, як видно з низьких фон з непов'язаними мРНК і ефективного відновлення цільової mRNAs (Малюнок 2Б). На даний момент ми хотіли б підкреслити можливість хрест гібридизації ASOs з іншими мРНК. Наприклад DNM1 Асо є повністю доповнює послідовність в DNM1 послідовності кодування, але він також частково anneals з 1 акт мРНК. DNM1 ASOs відновити обидва mRNAs незалежно від температури прання, показані сильну схильність до хрест гібридизації (рис. 2 c). Нарешті ми використовували вище описаних випробувань і оптимізації для вибору трьох ASOs, які були придатні для відновлення відповідних цільових mRNAs від усього РНК, ізольований від S. cerevisiae, C. elegans і людських клітин (2D фігура).

Після початкового відбору підходящих ASOs в пробірці, ми провели поїздки з клітинних екстрактів, отримані від УФ зшитий організмів / клітин (рис. 1). Зокрема, ми протестували відновлення трьох різних мРНК з трьох різних організмів: мРНК PFK2 з дріжджів S. cerevisiae, ВІС-1 від нематод C. elegans і репортер мРНК (pGL3-CDKN1B-3 'УТР) підшипник 3' УТР послідовність мРНК людини CDKN1B / p27 зливається з репортером люціферази (Люк) для перехідних вираз в клітинах людини HEK293. Для управління специфіка РНК ізоляції, ми моніторинг відновлення декількох незв'язаних мРНК, і ми провели експерименти конкуренції шляхом додавання надлишок ПА клітинних екстрактів, яка конкурує з прив'язкою стільникового мРНК oligo (dT) 25 намиста на першому етапі крок очищення. Як раніше побачене з не шитий всього зразків РНК (рис. 2), RT-PCR підтвердив збагачення відповідних mRNAs цільових мРНК під час поїздки, в той час як кілька не пов'язаних з управління мРНК не збагатить (рис. 3A). Крім того ні mRNAs були виявлені на вервиці без ASOs, вказавши відповідні блокування процедур, які уникнути неспецифічних прив'язки. На цій лінії не пов'язані / яєчня ASOs може також використовуватися як елемент управління, хоча потенціал для хрест гібридизації з певним мРНК і виводяться захоплення пов'язаних білків потім братися до уваги. Так як білки в заключному елюата може чи візуалізацію на срібло забарвлених поліакриламідних гелів (дані не показані), наявність раніше відомих мРНК взаємодії білків Далі оцінювали immunoblot аналізу. Це включає в себе Pfk2p від S. cerevisiae, які вибірково зв'язується з PFK2 мРНК рибосоми незалежним образом12; C. elegans GLD-1, канонічне ОДП, яка пов'язує 3 'УТР послідовності ВІС - 1 мРНК для трансляційного правіла43; і ГУР, ОДП, яка регулює стабільність мРНК і переклад p27 / CDKN1B мРНК44. Як і очікувалося, все з цих білків були визначені в поїздку Елюат відповідних mRNAs західній помарки аналізу (рис. 3B).

Малюнок 1. Схематичне представлення поїздки. Білки є високо структуровані РНК в природних умовах, УФ опромінення. На першому кроці (світло зелений прапорець) poly (A) РНК білкових комплексів відновлюються з бісером25 oligo (dT), застосовуючи жорсткі Пральна умови для видалення unbound протеїни. На другому етапі (рожевий ящик) цільової mRNP це потягнув поза з біотінілірованние антисмислових олігонуклеотидів РНК і стрептавідину намистини. Очищений mRNPs потім аналізуються RT-PCR та immunoblot / мас спектрометрія (МС) для визначення РНК і білків, що взаємодіють з mRNA інтересу, відповідно. Малюнок був змінений з попередньої публікаціі37 з дозволу. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 2. Ізоляція окремих mRNAs від загального РНК не зшитий клітин / організмів за допомогою зміни antisense РНК захоплення зонди. (А) вплив концентрацій солі на ефективності уловлювання дріжджів PFK2 мРНК з ASOs. Всього РНК від дріжджових клітин в поєднанні з зазначених ASOs і промивають буфер, що містить зазначений концентрація солі (NaCl) при температурі 55 ° C. Зелений, синій і помаранчевий лінії представляють PFK2 мРНК відновлення з різними ASOs як визначається ПЛР-37: PFK2-1 і PFK2 - 2 отжиг в 3 'УТР, PFK2-4 компакт-дисків. PFK1 це негативний контроль мРНК. ПЛР була виконана з 32 посилення циклів і кількісно як опісано37. (B) частина C. eleganscep-1 і дріжджі RPS20 Асо неминуче мРНК при температурах різних мити, представлені в чорної і червоної лініями, відповідно. C. eleganspgk-1 і дріжджі 1 акт є mRNAs непромислових (контроль). 30 і 32 циклів PCR були застосовані для виявлення дріжджів і C. elegans мРНК, відповідно. Схематичне уявлення гібридизації DNM1 Асо (червоний) з послідовностями мРНК DNM1, а також потенційних хрест гібридизації з 1 акт мРНК (C) відображається зліва. Гель агарози, показані товари з ПЛР-реакції (30 циклів) для виявлення дріжджів DNM1 і 1 акт мРНК цього eluted з бісеру показано праворуч. Вхід, всього РНК; SN, надосадке після інкубації з ASOs; E, Елюат з бісеру, промивають в вказано попереднього Елюювання температур (40 ° C, 50 ° C і 60 ° C). Управління експеримент (Ctrl) була виконана паралельно без додавання Асо. (D) агарози гель, показуючи продукти-ПЛР для виявлення mRNAs (праворуч) захопив від усього РНК дріжджів S. cerevisiae, C. elegans і HEK293 клітини людини (H. sapiens). Вхід, всього РНК; SN, супернатанта; E, Елюат з бісеру. ПЛР була виконана 30 циклів підсилювачі для дріжджів мРНК, 32 цикли для C. elegans мРНК, а 28 і 30 циклів для людини тубулін і p27 мРНК, відповідно. Малюнок був змінений з попередньої публікаціі37 з дозволу. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Малюнок 3. Захоплення конкретні мРНК білкових комплексів з екстрактів похідним від УФ високо структуровані клітин з поїздкою. Гелі агарози (A) для виявлення mRNAs (праворуч) з RT-PCR після захоплення з oligo (dT) і вказано ASOs від S. cerevisiae, C. elegans і витягів клітини людини (H. sapiens). Вхід, всього РНК із зшитого клітин / організмів; CTRL, управління без опа. Poly (A), конкуренція з poly (A). RT-PCR була виконана як опісано37 з 35 циклів ампліфікації Люк, 32 циклів для p27, і 29 циклів для тубуліну. (B) аналіз Immunoblot мРНК стрибну білків з зазначених антитіл (праворуч). Завантажений фракції є наступні: 0.1%, 2,5% і 1% для дріжджів, нематод і людських ресурсів; 10%, 10% і 5% для дріжджів, нематод і людини oligo (dT) смуг; і 66% для всіх смуг ASOs. Молекулярний вага (МВт), вказані в кДа (кДа). Малюнок, опублікована з разрешенія37. Будь ласка, натисніть тут, щоб подивитися велику версію цієї фігури.

Pfk2_Fwd GTGTTAAGGGTTCACATGTCG PFK2 S. cerevisiae 133 bp Pfk2_Rev CTTCCAACCAAATGGTCAGC PFK2 S. cerevisiae 133 bp Pfk1_Fwd GGTGATTCTCCAGGTATGAATG PFK1 S. cerevisiae 97 ВР Pfk1_Rev CTTCGTAACCTTCGTAAACAGC PFK1 S. cerevisiae 97 ВР Act1_Fwd GTCTGGATTGGTGGTTCTATC 1 акт S. cerevisiae 85 bp Act1_Rev GGACCACTTTCGTCGTATTC 1 акт S. cerevisiae 85 bp Dnm1_Fwd CTGTGTTCGATGCATCAGAC DNM1 S. cerevisiae 156 bp Dnm1_Rev CGCACTCCAATTCTTCTCTC DNM1 S. cerevisiae 156 bp Rps20_Fwd CGCTGAACAACACAACTTGG RPS20 S. cerevisiae 228 bp Rps20_Rev GGAAGCAACAACAACTTCGAC RPS20 S. cerevisiae 228 bp Cep1_Fwd CGATGAAGAGAAGTCGCTGT ВІС-1 C. elegans 110 bp Cep1_Rev ATCTGGGAACTTTTGCTTCG ВІС -1 C. elegans 110 bp Pgk1_Fwd GCGATATTTATGTCAATGATGCTTTC ПГК-1 C. elegans 74 bp Pgk1_Rev TGAGTGCTCGACTCCAACCA ПГК-1 C. elegans 74 bp Mpk1_Fwd TGCTCAGTAATCGGCCATTG МПК-1 C. elegans 74 bp Mpk1_Rev TCCAACAACTGCCAAAATCAAA МПК-1 C. eleg ans 74 bp p27_Fwd TTTAAAAATACATATCGCTGACTTCATGG P27 H. sapiens 212 bp p27_Rev CAAAGTTTATGTGCTACATAAAAGGTAAAAA P27 H. sapiens 212 bp Luc_Fwd AATGGCTCATATCGCTCCTGGAT люціферази P. pγralis 117 bp Luc_Rev TGGACGATGGCCTTGATCTTGTCT люціферази P. pγralis 117 bp Β-TUBULIN_Fwd CTGAACCACCTTGTCTCAGC Β-тубуліну H. sapiens 136 bp Β-TUBULIN_Rev AGCCAGGCATAAAGAAATGG Β-тубуліну H. sapiens 136 bp PFK2 -1 Асо AAUAGAAAGUGUAAUAAAAGGUCAU 3 'УТР PFK2 S. cerevisiae - PFK2 -2 Асо GUUUCAUGGGGUAGUACUUGU 3' УТР PFK2 S. cerevisiae - PFK2 -4 Асо CUUGAAGAGGAGCGUUCAUA ORF PFK2 S. cerevisiae - DNM1 АСО UCGGUCAGUGGAGGUUCAGCGUUU ORF DNM1 S. cerevisiae - RPS20 АСО GUCGGUAAUAGCCUUCUCAUUCUUG ORF RPS20 S. cerevisiae - ВІС-1 АСО GUGAGAAAUGCGGUGCUUUGAAA 3 'УТР C. elegans ВІС-1 - p27 АСО UCAUACCCCGCUCCACGUCAGUU 3' УТР p27 H. sapiens -

Таблиці 1. Послідовності олигонуклеотида. Список праймери PCR і ASOs, використовувані в цій роботі, послідовність праймера, цільових генів і розмір очікуваних фрагментів після посилення.